少壮不努力，老大徒伤悲丨中外合作Nature报道成年以后神经元不能产生了

BioArt按：到目前为止，关于成年之后神经发生在灵长类的皮层和海马是否存在一直存在争议。半个世纪以来，不同的科学家使用不用的实验方法得出了不一样的结论。然而刚刚在线的一篇由UCSF的Arturo Alvaez Buylla实验室、复旦大学脑科学研究院杨振刚实验室和西班牙巴伦西亚大学(Universidad de Valencia) Jose Manuel Garcia-Verdugo实验室合作完成的Nature论文表明人的海马在成年之后也不会有神经发生，对成年之后神经发生作为可塑性一种的理论提出了否定性证据。同期Nature发布的新闻与观点评述文章中也对该工作进行了评论。为了让读者朋友全面了解围绕成年后神经发生这一重大科学问题的相关争议和整个学术研究历程，BioArt特别邀请到了神经生物学白可豪博士撰文详述，以飨读者！

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撰文丨白可豪

关于大脑的重要性已经在多个场合被提及，作为本文的开始，我想已经不用再过多的提起。 然而大脑功能令人着迷的一个地方在于，出生之后大体结构已经构建完毕的器官如何应对不可预测的，多样性的环境，并产生可靠而又牢固的经验，指导有机体进一步学习和应对新的挑战。现在我们已经知道大脑可以通过不止一种机制来应付这些挑战， 比如LTP/LTD， 突触的发生和消减等等。在众多可备使用的机理中，产生新的神经元来处理新的信息这一假说则经历了反复论证，百家争鸣，至今仍然无法给出一个确切的结论。

让我们首先回到从前。在绘制出分子生物学基本蓝图之后， 许多科学家开始将注意力转移到基因如何通过影响神经系统的结果影响行为。为此据说专门组织了一个会议，讨论选择何种模式生物为突破口了解大脑的功能， 这个会议的参与者当时基本囊括了后来神经科学里的领军人物。 会议的结果是Sydney Brenner选择了线虫，Seymour Benzer 选择了果蝇， Eric Kandel 选择了海兔，而Richard Sidman选择了小鼠。 在这里面，前面三个名字对于所有学习神经科学的研究生来说大概耳熟能详， 最后一个则显得有些陌生， 原因大概也与当时利用小鼠得到的数据不能够像前面三位那样系统而详实不无关系。 其实Richard Siman在1960年代已经培养了许多具有突变表型的小鼠【1】，也mapping出其中一些小鼠基因突变可能的位点。 然而受到当时技术条件以及小鼠本身的限制，这些小鼠无法回答神经发育的基本过程， 因此Richard Sidman无法向果蝇以及线虫里的同事一样快速鉴定基因如何影响神经发育。可见在科学研究的过程中选择一个好的研究对象对于快速回答一些重要的科学问题也是至关重要的。

除了合适的研究对象外，一个好的方法和途径(Approach)往往也能推动一个领域的发展，这一点在神经科学则尤为明显。1950年代开发的3H标记的胸腺嘧啶就是一个例子。它的广泛使用极大的促进了对神经发生(Neurogenesis)的研究。因为新的细胞类型产生多数要通过细胞分裂之后进而通过命运决定而完成。 这个过程需要合成DNA，因此动物体内给予的3H标记的胸腺嘧啶就可以插入新产生的细胞的DNA，使得细胞可以通过放射显影被标记出来(此处可联想DNA半保留复制中的同位素标记实验， 以及蛋白质运输过程中的pulse chase实验)。 而如果一个新产生的细胞分化为神经元的话，那么这些被标记的胸腺嘧啶则因为神经元的不可分裂的特性而留在了该神经元的细胞核里。利用这一特性，Richard Sidman 和当时参会的另一位科学家，现为耶鲁大学教授的Pasko Rakic 分别向小鼠和恒河猴体内注射这种被标记的胸腺嘧啶， 分别在不同的时间点观察被标记的细胞，得到了现在写进教科书里的”后来居上“的迁移模式【2,3】。

既然能够标记发育时期的神经元， 那理论上也应该能标记成年状态下产生的神经元， 如果有的话。这样一来就可以直接回到成年之后大脑是否可以利用产生新的神经元的方式处理日渐增多的信息。为此Pasko Rakic在成年的猴子体内进行了这样一个实验， 并于1985年在Science中宣称在恒河猴的皮层在出生之后不再有神经发生【4】，这似乎表明在灵长类的大脑皮层，神经发育的蓝图在出生之前也已完成，后天对环境的适应和改造似乎是在神经系统的其他与神经发生不相关的层面上进行。其实早在研究胚胎时期的神经发育的时候Pasko就发现猴子在出生之后皮层内产生的新的神经元几乎可以忽略。因此这一成年的发现也是他前期发现的一个补充。 这些似乎表明在非人灵长类，神经发生在理解大脑功能和治疗疾病上并非首选。

那么这样一个发现与前人的结论相比如何呢? 事实上关于成年之后的神经发生现象并非很晚才被关注。 现代神经科学之父西班牙科学家Cajal在经过长期而细致的观察并结合其他组织学家的发现，认为包括人在内的许多动物的大脑皮层在成年之后没有神经发生的现象【5】。在此之前，1958年加拿大McGill的B.Meisser等通过向新成年小鼠(13g) 皮下注射的方式， 观察到在大脑皮层被标记的细胞。因此推测在大脑皮层基本结构发育完成之后，仍然存在着产生新的细胞的能力，但不能确定是否为神经元【6】。1961又对完全成年的小鼠(26-28g) 进行皮下注射， 发现在亚脑室区仍然能够观察到大量被标记的细胞，但是在皮层却未能观察到被标记的细胞【7】。1960年Brigitte Schultze 和 Wolfgang Oehlert通过在大鼠腹腔注射3H-T，并未在中枢神经系统发现被标记的神经元【8】。 以上这些实验似乎更进一步证实了这样一个结论: 大脑内神经元的数目在出生之前就已恒定，大脑不会通过增加神经元的方式应对环境和修复损伤。

争论: 

“一些人认为Altman应该因为这个发现得诺贝尔奖， 不过他在2016他去世了”

然而这样的结论被来自MIT的Joeseph Altman否定了。Altman是一位犹太人，经历磨难移民到美国，通过自学而得到在纽约大学进行研究生学习的机会。后来在MIT作为独立的研究博士后期间，他的工作在成年神经发生领域搅起了一阵波澜。让我们简单的过一遍他在1960年代的几篇代表性论文：

1962年Joeseph Altman 在Science发文称通过颅内注射(intracranial injection)H3标记的胸腺嘧啶，在成年大鼠的皮层发现了被标记的神经元【9】。

1963年Joeseph Altman 在Anatomy Record 发表论文称通过给新成年 (Young Adult)大鼠腹腔注射或者给成年的猫通过脑室注射3H-T均能够在皮层观察到被标记的椎体细胞，在海马观察到被标记的颗粒细胞；在成年猫的皮层看到被标记的神经元【10】。

1965年 Joeseph Altman对经过连续接受腹腔注射的成年大鼠 (4 months) 进一步分析，发现在海马能够被标记的颗粒细胞数目随大鼠年龄增加而减少， 且这一过程伴随海马体内业已分化的颗粒细胞数的增多。 这一结果提示神经发生的潜力随年龄增大而降低【11】。

1967年Joeseph Altman 在新生或6天大的豚鼠进行实验证实在出生后豚鼠的海马和小脑能够标记新生的颗粒细胞。因为豚鼠出生之后可以行走，因此大脑在新生阶段较大鼠和小鼠更为成熟，因此提示新形成的神经细胞可能对应于后面学习之后的行为控制【12】。

可以说Altman的这几项研究似乎表明成年啮齿类的神经发生是一个广泛存在的现象，如果这一现象属实将无疑具有开创一个新的领域的价值。然而， 尽管Altman在Nature和Science上报道了他惊世骇俗的发现，他还是没能进入MIT的tenure track系统，后来转到普度大学进行利用有限的经费继续他的研究。而这些研究的结论也因为不能排除一些其他因素的干扰， 没有被学术界广泛接受。后来啮齿类海马、嗅球等脑区的成年神经发生被广泛研究的时候，一些人认为Altman应该因为这个发现得诺贝尔奖， 不过他在2016他去世了。

除了Altman之外，也有其他科学家得到了相同的结论。 1977年Boston大学医学院的Michael S. Kaplan为了克服成像过程中的误差造成的影响以及更清晰的观察到细胞的形态。利用电子显微镜对经过注射3个月的大鼠超薄切片进行分析，在嗅球和海马均发现了被标记的颗粒细胞，证实在成年哺乳动物的嗅球和海马存在神经发生【13】， 并观察到了成神经细胞【14】。 他后来的工作也表明在新皮质有被标记的胶质细胞【15】， 并且经过丰富环境刺激之后，在视觉皮层的第四层观察到了被标记的颗粒细胞【16】。 但是由于他丢失了切片，所以这些结果无法得以复查。据Kaplan自己说因为后来得不到足够的研究经费，他转行做了大夫。

不仅在哺乳动物， 鸟类的研究也支持成年动物大脑内仍旧有神经发生的现象【17,18】。 1960年代来自阿根廷在UC Berkley获得动物学博士的Fernando Nottebohm 在洛克菲勒大学开始了他的独立研究生涯。研究生时期Fernando Nottebohm跟随导师Peter Marler 进行动物运用声音进行交流的研究。他们选择的研究对象是一种叫做苍头燕雀(也称为song bird)的鸟。 这种鸟在发育的特定时期会学会不同的鸣叫， 例如在性成熟求偶期的鸣叫就与普通的鸣叫不同， 而且不同地区的同一种鸟的鸣叫也不尽相同。因此他们认为这种鸟可以作为一个很好的研究对象来回答nature和nurture的问题，甚至有可能为人类语言的学习提供insights【19】。金丝雀做为众多song bird中其中的一种, “唱歌” 现象主要发生在性成熟的雄性鸟类。在雄性金丝雀中有2个核团与唱歌现象有关，这2个核团在雄性鸟类中大于雌性。 雌性在经过睾丸酮处理之后有的也能发生唱歌求偶现象， 而发生求偶现象的雌性中这两个核团体积会增大。 此外在雄性鸟类中， 这两个核团在求偶的春季会变大， 在哺育期之后的秋季又会萎缩。 因此这2个核团成为了成年之后神经发生是否能够作为学习的基础的试金石。

因此Fernando Nnottebohm的实验室利用雌性金丝雀在接受睾丸酮注射之后会唱歌这一现象做了一个利用3H标记的实验， 他们发现不论注射睾丸酮与否，在成年雌性金丝雀的负责唱歌的合团都有相同比例的神经被标记上， 但是接受睾丸酮刺激的金丝雀有更多的胶质细胞被标记上， 这一结论表明在成年的金丝雀体内存在神经发生的现象【20】。 但是他们发现在雄性金丝雀的负责唱歌的核团可标记的神经元的数目在每年的3月份和10月份最多, 表明成年的神经发生还是跟求偶时鸣叫的能力加强有关【21】。Fernando在金丝雀的神经发生工作中还做了其他大量的工作。从他实验室出来的Arturo Alvaez Buylla 独立以后在UCSF利用小鼠对成年神经发生的方式，起源等进行了详细的描述【22-24】, 这在分子生物学的黄金年代显得尤为可贵. 近年, Buylla的工作由小鼠转向人【25】。

有了鸟类，小鼠和大鼠的证据之后，下一个就是来自猴子甚至是人体研究的证据来使得这些研究能够为我们了解自身提供证据。1999年普林斯顿大学的Gould利用一种原理与前文所述标记的胸腺嘧啶类似，新的DNA 标记物BrdU注射成年的恒河猴，并结合免疫染色，报道在跟学习等高级功能相关的大脑皮层区域发现了被标记的神经元【26】。 后来他们在海马也发现了类似的成年神经发生的现象，在大鼠中的实验则认为这些新产生的神经元参与到新的偶联性记忆的形成【27-29】。这些证据加上1998年Salk研究所的Fred Gage将Brdu注射到病人志愿者体内，并在病人的海马发现了被标记的颗粒细胞，这个实验似乎表明成年神经发生是一种保守并广泛存在的现象【30】。

如果这些现象真实存在，将为我们理解学习记忆提供新的视角甚至为转化医学提供新的治疗契机， 因此产生了很大的影响。在这些结果的基础上也诞生了许多非常有意思的发现， 比如运动或者学习记忆能促进神经发生等等。 但是这些研究与Pasko的结论不同。为此Pasko重新利用Brdu在猴子身上试验， 除了能在海马发现被标记的细胞， Pasko Rakic结合自身多年观察的结果对灵长类新皮质的成年神经发生的现象依然持保留态度并提出了自己的观点， 他认为那些被标记的细胞不是神经元【31-34】。哈佛的Jeffrey Macklis实验室甚至发现在正常的情况下甚至小鼠的新皮层都不会发生神经发生现象【35】。 而且瑞典卡罗林斯卡研究所的Jonas Frisen实验室通过测量DNA中14C的衰变推测细胞产生的时间，并结合人的出生日期，发现在人成年之后皮层几乎没有新的神经元产生【36】， 而海马和纹状体有新的神经元产生【37-38】。这些证据总结起来似乎表明目前只有皮层在成年之后是否有神经发生存在争议, 而嗅球、 海马等脑区在成年好之后的发生神经发生被得到了肯定。

最新的进展

由于以往的实验多是利用免疫组化的切片在显微镜下观察，因此结论有不同也能理解。 更加可信的证据应该是用遗传标记神经前体细胞，并对这些细胞在成年之后的命运实行实时观察。 在这一点上，小鼠就显得比较有优势。 2018 年Fred Gage 曾经的博后，现在瑞士苏黎世大学的Sebastian Jessberger 通过红色荧光蛋白遗传标记神经前体细胞，并结合双光子成像对成年小鼠(10周左右) 的海马进行在体实时成像分析。通过观察他们发现在成年小鼠的海马齿状回存在新的神经元产生【39】 。这一实验证据算是很充分的证实了在成年小鼠的海马存在神经发生。

然而就在学术界基本已经接受在海马广泛存在成年之后的神经发生的时候。刚刚在线发表的，来自UCSF的Arturo Alvaez Buylla实验室、复旦大学脑科学研究院杨振刚和西班牙巴伦西亚大学(Universidad de Valencia) Jose Manuel Garcia-Verdugo的证据似乎表明人的海马在成年之后也不会有神经发生。他们利用发育不同时段的人和猴的组织进行免疫染色。通过分析组织上着色的分子标记物， 他们认为在人和猴子的海马随着发育的成熟， 神经发生的能力逐渐降低【40】, 因此也对成年之后神经发生作为可塑性一种的理论提出了否定性证据。

所以目前为止至于成年之后神经发生在灵长类的皮层和海马是否存在仍然存疑。不同的科学家对此也采取了不同的态度。随着遗传学操作和成像技术的不断进步， 相信在不久的将来这一问题会得到更充分的回答。

参考文献：

1 Sidman, R. L., Appel, S. H. & Fullier, J. F. Neurological Mutants of the Mouse. Science 150, 513-516, doi:10.1126/science.150.3695.513 (1965).

2 Angevine, J. B., Jr. & Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature 192, 766-768 (1961).

3 Rakic, P. Neurons in Rhesus-Monkey Visual-Cortex - Systematic Relation between Time of Origin and Eventual Disposition. Science 183, 425-427, doi:DOI 10.1126/science.183.4123.425 (1974).

4 Rakic, P. Limits of neurogenesis in primates. Science 227, 1054-1056 (1985).

5 Cajal, S. R. y. Histology of the Nervous System.  II.

6 Messier, B., Leblond, C. P. & Smart, I. Presence of DNA Synthesis and Mitosis in the Brain of Young Adult Mice. Exp Cell Res 14, 224-226, doi:Doi 10.1016/0014-4827(58)90235-0 (1958).

7 Smart, I. The subependymal layer of the mouse brain and its cell production as shown by radioautography after thymidine-H3 injection. The Journal of Comparative Neurology 116, 325-347, doi:10.1002/cne.901160306 (1961).

8 Schultze, B. & Oehlert, W. Autoradiographic Investigation of Incorporation of H3-Thymidine into Cells of the Rat and Mouse. Science 131, 737-738, doi:DOI 10.1126/science.131.3402.737 (1960).

9 Altman, J. Are new neurons formed in the brains of adult mammals? Science 135, 1127-1128 (1962).

10 Altman, J. Autoradiographic investigation of cell proliferation in the brains of rats and cats. Anat Rec 145, 573-591 (1963).

11 Altman, J. & Das, G. D. Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats. J Comp Neurol 124, 319-335 (1965).

12 Altman, J. & Das, G. D. Postnatal neurogenesis in the guinea-pig. Nature 214, 1098-1101 (1967).

13 Kaplan, M. S. & Hinds, J. W. Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. Science 197, 1092-1094 (1977).

14 Kaplan, M. S. & Bell, D. H. Mitotic neuroblasts in the 9-day-old and 11-month-old rodent hippocampus. J Neurosci 4, 1429-1441 (1984).

15 Kaplan, M. S. & Hinds, J. W. Gliogenesis of astrocytes and oligodendrocytes in the neocortical grey and white matter of the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs. J Comp Neurol 193, 711-727, doi:10.1002/cne.901930309 (1980).

16 Kaplan, M. S. Neurogenesis in the 3-month-old rat visual cortex. J Comp Neurol 195, 323-338, doi:10.1002/cne.901950211 (1981).

17 Alvarezbuylla, A., Theelen, M. & Nottebohm, F. Birth of Projection Neurons in the Higher Vocal Center of the Canary Forebrain before, during, and after Song Learning. P Natl Acad Sci USA 85, 8722-8726, doi:DOI 10.1073/pnas.85.22.8722 (1988).

18 Alvarezbuylla, A. & Nottebohm, F. Migration of Young Neurons in Adult Avian Brain. Nature 335, 353-354, doi:DOI 10.1038/335353a0 (1988).

19 Nottebohm, F. Peter Marler (1928-2014). Nature 512, 372, doi:10.1038/512372a (2014).

20 Goldman, S. A. & Nottebohm, F. Neuronal production, migration, and differentiation in a vocal control nucleus of the adult female canary brain. Proc Natl Acad Sci U S A 80, 2390-2394 (1983).

21 Kirn, J., O'Loughlin, B., Kasparian, S. & Nottebohm, F. Cell death and neuronal recruitment in the high vocal center of adult male canaries are temporally related to changes in song. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 7844-7848 (1994).

22 Lois, C. & Alvarez-Buylla, A. Long-distance neuronal migration in the adult mammalian brain. Science 264, 1145-1148 (1994).

23 Lois, C., Garcia-Verdugo, J. M. & Alvarez-Buylla, A. Chain migration of neuronal precursors. Science 271, 978-981 (1996).

24 Doetsch, F., Caille, I., Lim, D. A., Garcia-Verdugo, J. M. & Alvarez-Buylla, A. Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell 97, 703-716 (1999).

25 Paredes, M. F. et al. Extensive migration of young neurons into the infant human frontal lobe. Science 354, doi:10.1126/science.aaf7073 (2016).

26 Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S. & Gross, C. G. Neurogenesis in the neocortex of adult primates. Science 286, 548-552 (1999).

27 Gould, E. et al. Hippocampal neurogenesis in adult Old World primates. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5263-5267 (1999).

28 Macklis, J. D. Neurobiology: New memories from new neurons. Nature 410, 314-315, 317, doi:10.1038/35066661 (2001).

29 Shors, T. J. et al. Neurogenesis in the adult is involved in the formation of trace memories. Nature 410, 372-376, doi:10.1038/35066584 (2001).

30 Eriksson, P. S. et al. Neurogenesis in the adult human hippocampus. Nat Med 4, 1313-1317, doi:10.1038/3305 (1998).

31 Kornack, D. R. & Rakic, P. Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 5768-5773 (1999).

32 Rakic, P. Neurogenesis in adult primate neocortex: an evaluation of the evidence. Nat Rev Neurosci 3, 65-71, doi:10.1038/nrn700 (2002).

33 Rakic, P. Young neurons for old brains? Nat Neurosci 1, 645-647, doi:10.1038/3643 (1998).

34 Kornack, D. R. & Rakic, P. Cell proliferation without neurogenesis in adult primate neocortex. Science 294, 2127-2130, doi:10.1126/science.1065467 (2001).

35 Magavi, S. S., Leavitt, B. R. & Macklis, J. D. Induction of neurogenesis in the neocortex of adult mice. Nature 405, 951-955, doi:10.1038/35016083 (2000).

36 Spalding, K. L., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B. A., Druid, H. & Frisen, J. Retrospective birth dating of cells in humans. Cell 122, 133-143, doi:10.1016/j.cell.2005.04.028 (2005).

37 Spalding, K. L. et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell 153, 1219-1227, doi:10.1016/j.cell.2013.05.002 (2013).

38 Ernst, A. et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell 156, 1072-1083, doi:10.1016/j.cell.2014.01.044 (2014).

39 Pilz, G. A. et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science 359, 658-662, doi:10.1126/science.aao5056 (2018).

40 Sorrells, S. F. et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature, doi:10.1038/nature25975

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